بیان و هدفگیری انسولین انسانی در گیاه با استفاده از یک سامانه بیانی مبتنی بر حامل ویروس گیاهی

پذیرفته شده برای ارائه شفاهی
کد مقاله : 1102-25IPPC (R1)
نویسندگان
1عضو هیات علمی جهاد دانشگاهی
2گروه بیماری شناسی دانشگاه تربیت مدرس
چکیده
یک حامل ویروس گیاهی حاصل از همسانه آلوده کننده ی ویروس موزاییک زرد کدو (Zucchini yellow mosaic virus:ZYMV) برای بیان انسولین انسانی در گیاه استفاده شد. ژن پروانسولین میان ژنهای P1 و HC-Pro در ZYMV قرار داده شد. شش اسید امینه هیستیدین و یک سایت شکست پروتئازی در انتهای کربوکسیلی آن اضافه شد تا به ترتیب ردیابی و رهاسازی انسولین بیان شده تسهیل گردد. همچنین از سیگنال پپتید کلروپلاستی و توالی SEKDEL به ترتیب در انتهای آمینی و کربوکسیلی برای هدفگیری انسولین به داخل کلروپلاست و شبکه اندوپلاسمی استفاده شد. آلوده کنندگی حامل ویروسی نوترکیب توسط مالیدن پلاسمید روی برگ سلمه تره (Chenopodium quinoa) و مشاهده لکه موضعی تایید شد. یک لکه موضعی برای مایه زنی برگهای اسکواش به روش مکانیکی به کار رفت و این گیاهان 5، 10، 15 و 20 روز بعد از مایه زنی نمونه برداری و در آزمون الایزا و وسترن بلات استفاده شدند. بررسی گیاهان مایه زنی شده با الایزا و وسترن بلات نشان داد که پروتئین انسولین در برگهای اسکواش بیان شده است. نتایج RT-PCR نشان داد که حامل نوترکیب 30 روز بعد از مایه زنی و پس از هفت بار انتقال پایدار بود. همچنین بررسی کمی میزان پروتئین انسولین در تیمارهای مختلف نشان داد هدف‌گیری انسولین با استفاده از پپتید نشانه SEKDEL به شبکه‌ی اندوپلاسمی، میزان بیان پروتئین نوترکیب را به طور معنی داری افزایش داده است. این فرایند روش آسان و سریعی برای تولید مقدار زیاد انسولین در گیاه را فراهم می کند. این سامانه ظرفیت تولید پروتئین‌های دیگر مورد نظر در کدوئیان را دارد که برای اهداف تولید آنتی‌ژن، کاربردهای دارویی، مطالعه‌ی عملکرد ژن، تولید انبوه خوراک دام و سایر موارد کاربرد دارد.
کلیدواژه ها
 
Title
Expression and targeting of human insulin using a plant virus-based expression system in planta
Authors
Satyed Mohsen Nassaj Hoseini, Masoud Shamsbakhsh
Abstract
A plant viral vector engineered from an in vivo infectious clone of Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) was used to express the human insulin in planta. The proinsulin gene was in frame inserted between the P1 and HC-Pro genes of the ZYMV vector. Six histidine residues and a NIa protease cleavage site were added at the C-terminal region of the inserts to facilitate detection and process of free form of the expressed insulin, respectively. Also, N-terminal chloroplast signal peptide and C-terminal SEKDEL sequence was used to target insulin into chloroplast and endoplasmic reticulum (ER), respectively. The infectious activity of the recombinant vectors was approved by rubbing the plasmid on Chenopodium quinoa mechanically and observing local lesions. A single local lesion was inoculated on zucchini squash leaves and these plants were sampled 5, 10, 15 and 20 days after inoculation. Analysis of inoculated plants by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and western blot indicated that insulin protein was expressed in Squash leaves. RT-PCR result showed the recombinant vector was remarkably stable in squash for seven serial passages and after 30 days. Also, targeting of proinsulin using SEKDEL retention signal showed that targeting of the proinsulin to ER increased expression level of recombinant protein significantly. This procedure provides a convenient and fast way for production of large quantities of insulin in planta. This system has a potential for production of other proteins of interest in cucurbits to immunogen production, pharmaceutical applications, study on gene function, mass production of animal feed or use for other purposes.
Keywords
transient expression, Recombinant protein, molecular farming