شناسایی مولکولی برخی از عوامل ویروسی و ویروئیدی در درختان مرکبات با علائم زوال در استان مازندران
پذیرفته شده برای ارائه شفاهی
کد مقاله : 1785-25IPPC (R1)
نویسندگان
1دانشجوی دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری
2دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری
3موسسه تحقیقات گیاهپزشکی کشور
چکیده
اخیرا عارضه زوال مرکبات به ویژه در مناطق مرکزی استان مازندران گسترش شدیدی یافته است. در درختان دچار زوال علائمی چون سرخشکیدگی، رنگ پریدگی، کاهش رشد، ساقه آبلهای، عدم جوانهزنی، ضعف، صمغ زیر پوست و در مواردی پوسته پوسته شدن تنه و مرگ سریع درخت مشاهده میشود. در این تحقیق، ویروس تریستزای مرکبات (CTV)، ویروس پسوروز مرکبات CPV))، ویروئید اگزوکورتیس مرکبات (CEVd) و ویروئید کوتولگی رازک (HSVd) در درختان مرکبات با علائم زوال مورد بررسی قرار گرفتند. بدین منظور، در پاییز و زمستان 1402 و بهار 1403 از درختان رو به زوال در مناطق مرکزی استان مازندران شامل ساری، قائمشهر، سیمرغ، جویبار و بابل نمونه-برداری صورت گرفت. نمونهبرداری بطور تصادفی از 76 درخت با سن متوسط بین 6 تا 40 سال شامل ارقام تامسون، پرتقال خونی، پرتقال محلی، نارنگی انشو، نارنگی پیج، و پایههای نارنج، سیترنج و سیتروملو انجام شد. RNA کل از همه نمونهها از رگبرگ و دمبرگ گیاه استخراج شد. سپس تمام نمونهها با روش نسخهبرداری معکوس (RT) و آزمون واکنش زنجیرهای پلیمراز (PCR) با استفاده از آغازگرهای اختصاصی برای تکثیر بخشی از ژن پروتئین پوششی ویروس تریستزای مرکبات (CTV-CPF/R) و ویروس پسوروز مرکبات CPV1-F/CPV2-R))، و نیز آغازگرهای اختصاصی ویروئید اگزوکورتیس مرکبات (CEVd-F1/R1) و ویروئید کوتولگی رازک (HSVd-F1/R1) بررسی شدند. نتایج الکتروفورز ژل آگارز نشان داد که واکنش PCR با موفقیت قطعهای به طول تقریبی 504 جفتباز از ژن CTV را در 36 نمونه تکثیر کرده، در حالیکه هیچ قطعۀ اختصاصی در ناحیهی مورد انتظار برای CPV تکثیر نشد. ارزیابی محصولات PCR بیانگر تکثیر قطعه 371 جفتبازی برای CEVd (در 46 نمونه) و 299 جفتبازی برای HSVd (در 48 نمونه) بود. در بین نمونههای آلوده به CTV، 34 نمونه دارای پایه نارنج بوده، یک نمونه دارای پایه سیتروملو و یک نمونه دارای پایه سیترنج بودند. در نمونههای آلوده به HSVd، 42 نمونه دارای پایه نارنج و چهار نمونه دارای پایه سیتروملو و دو نمونه دارای پایه سیترنج بودند. در نمونههای آلوده به CEVd، 39 نمونه دارای پایه نارنج، چهار نمونه دارای پایه سیتروملو و سه نمونه دارای پایه سیترنج بودند. به منظور تایید نتایج PCR، پنج جدایه از CTV (از هر منطقه یک جدایه)، پنج جدایه از CEVd و پنج جدایه از HSVd از هر دو جهت توالییابی گردیدند. نتایج بلاست توالیهای نوکلئوتیدی نشان داد که جدایههای تعیین توالی شدهی CTV دارای تشابه 50/97 تا 80/99 درصدی با سایر جدایههای ثبت شده در GenBank میباشند. در حالیکه جدایههای توالییابی شده HSVd و CEVd دارای تنوع نوکلئوتیدی بالایی بوده و به ترتیب دارای تشابه 92 تا 100 درصدی و 80/93 تا 50/99 درصدی با جدایههای همتای خود در GenBank بودند. نتایج این تحقیق گزارشی از وضعیت برخی از ویروسها و ویروئیدهای همراه با عارضه زوال مرکبات در کانونهای درگیر در استان مازندران در سال جاری میباشد.
کلیدواژه ها
Title
Molecular identification of some viral and viroid agents in citrus trees showing decline symptoms in Mazandaran province
Authors
Zahra Tavakoli, Zohreh Moradi, Farid Beiki, Mohammad Ali Tajick Ghanbary
Abstract
In recent years, citrus decline disorder has significantly spread in the central areas of Mazandaran province. Affected trees exhibit symptoms such as dieback, paleness, reduced growth, stem pitting, lack of germination, weakness, gummy bark, and, in some cases, scaly bark accompanied by rapid decline. In this research, citrus tristeza virus (CTV), citrus psorosis virus (CPV), citrus exocortis viroid (CEVd) and hop stunt viroid (HSVd) were investigated in citrus trees that display these decline symptoms. For this purpose, during Autumn 2023, and Winter and Spring 2024, trees showing decline symptoms were sampled from the central regions of Mazandaran province including Sari, QaemShahr, Simorgh, Juybar and Babol. A total of 76 samples were randomly collected, representing trees with an average age ranging from 6 to 40 years and including cultivars such as Thomson orange, Blood orange, local orange, Citrus Unshiu, Page Mandarin, and rootstocks like sour orange, citrange, and citrumelo. Total RNA was extracted from all samples taken from the vein, and petiole. Subsequently, all samples were tested by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) using specific primers to amplify a segment of the coat protein (CP) gene of citrus tristeza virus (CTV-CPF/R) and citrus psorosis virus (CPV1-F/CPV2-R), as well as specific primers for citrus exocortis viroid (CEVd-F1/R1) and hop stunt viroid (HSVd-F1/R1). Results of agarose gel electrophoresis revealed that the PCR assay successfully amplified a fragment of approximately 504 bp in size from the CP gene of CTV in 36 samples, while no DNA fragment of the expected size was amplified for CPV. The evaluation of PCR products indicated the amplification of a 371 bp fragment for CEVd (in 46 samples) and a 299 bp fragment for HSVd (in 48 samples). Among the samples infected with CTV, 34 samples had sour orange rootstock, one had citrumelo rootstock, and one had citrange rootstock. In samples infected with HSVd, 42 samples had orange rootstock, four samples had citrumelo rootstock, and two samples had citrange rootstock. In the CEVd infected samples, 39 samples had orange rootstock, four samples had citrumelo rootstock, and three samples had citrange rootstock. To validate the PCR results, five isolates of CTV (one from each region), five isolates of CEVd, and five isolates of HSVd were sequenced in both directions. BlastN search showed that the sequenced CTV isolates shared 97.50 to 99.80% nucleotide identities with other isolates recorded in GenBank. While the sequenced isolates of HSVd and CEVd showed high nucleotide diversity and shared 92 to 100% and 93.80 to 99.50% identities with their counterpart isolates available in GenBank, respectively. Results of this research provide a report on the status of some viruses and viroids associated with citrus decline disorder in the affected areas in Mazandaran province during the current year.
Keywords
Citrus tristeza virus, Hop stunt viroid, Citrus exocortis viroid, Sudden death of citrus trees