متاژنومیکس میکروبی: مطالعه میکروبیوم یک نماتد بومی مرتبط با حشرات از طریق تکنولوژی توالی‌یابیNGS

پذیرفته شده برای ارائه شفاهی
کد مقاله : 1858-25IPPC
نویسندگان
عضو هیئت علمی
چکیده
تکنیک متاژنوم به‌عنوان یکی از‌روش‌های تکنولوژی توالی‌یابی نسل جدید Next generation sequencing (NGS)، یک روش مناسب و مستقل از کشت است که سبب ارائه عرصه‏‏‏ای جدید در‌شناسایی پروفایل میکروبی ارگانیسم‌های مفید از‌جمله نماتد‌های بیمارگر و مرتبط با-حشرات و درک رابطه‌ی بین این نماتد‌ها و میکروبیوم آن‌ها گردیده است. نظر به‌پتانسیل نفوذ، تولیدمثل و زهرآگینی قابل‌توجه مشاهده شده در جدایه نماتد بومی Acrobeloides sp. در برخی آفات مهم اقتصادی از‌جمله کرم خراط در مطالعات پیشین نگارندگان، جهت مطالعه دقیق و دستیابی به‌درک عمیق‌تر از باکتری‌های مرتبط یا هم‏زیست با‌مرحله زیستی لارو عفونت‌زای آن، در پژوهش حاضر پروفایل میکروبیوم لارو عفونت‌زای این نماتد بومی با‌استفاده از تکنولوژی توالی‌یابی نسل جدید توسط روش متاژنومیکس مورد آنالیز قرار گرفت. پس از استخراج DNAژنومی با استفاده از کیت استخراج از بافت طبق پروتکل ارائه شده توسط شرکت سازنده، غلظت وخلوص آن با‌استفاده از دستگاه نانودراپ و کیفیت توسط ژل الکتروفورز آگارز یک درصد مورد ارزیابی قرار گرفت. سپس با آماده‌سازی کتابخانه DNA متاژنومی و تکثیر یک قطعه 466 جفت‌بازی از ناحیه‌ی V4-V3 ژن 16S rRNA ریبوزومی، ساخت کتابخانه آمپلیکون این ناحیه‌ی ژنی، با استفاده از پلتفرم Illumina مدل MISeq، توالی‌یابی NGSبه روشpaired-end با طول 250 جفت‌باز انجام شد. جهت آنالیز متاژنوم باکتریایی و ارزیابی فیلوژنتیکی، پس از بررسی کیفیت فایل‌‌های خامfastq حاصل، آنالیز داده‌های مذکور پس از تریم و شناسایی و حذف توالی‌های کایمر به‌همراه توالی‌های آداپتور و پرایمر با‌استفاده از نرم‌افزار Qiime 2 انجام شد. تخصیص تاکسونومیک آمپلیکون‌ها (ASV) Amplicon sequence variant با‌استفاده از پایگاه داده تاکسونومیکSILVA 138 SSURef NR99 به‌عنوان پایگاه داده مرجع انجام شد. این تخصیص تاکسونومیک جوامع میکروبی جدایه‌ی نماتد Acrobeloides sp. در سطوح مختلف رده‏بندی، از سطح شاخه تا گونه تعیین و به-این ترتیب پروفایل میکروبیاتای لارو عفونت‌زای این نماتد تعیین شد. به‌منظور ارزیابی غنا (Richness) و یکنواختی (Evenness) میکروبیوم نماتد، تنوع آلفا با استفاده از سه شاخص مختلف شامل فراوانی OTUs مشاهده شده، شاخص تنوع شانون، و شاخص تنوع سیمپسون محاسبه شد. نتایج آنالیز فیلوژنتیکی میکروبیوم این نماتد نشان داد باکتری‌های متعلق به‌شاخه Proteobacteria ، Bacteriodota و Firmicutes به‌ترتیب با 7/42 ، 4/29 و 3/18 در صد بیشترین تعداد را داشتند. از نظر فراوانی، جنس Alcaligenes sp. با 9/11 در صد فراوان‌ترین و پس از آن Myxococcus، Acinetobacter و Pseudomonasبیشترین تعداد از باکتری‌های موجود در میکروبیوم مورد مطالعه را داشتند. نتایج ارزیابی تنوع زیستی میکروبیوم این نماتد با استفاده از شاخصه‌های شانون، سیمپسون و Chao1 و هم‏چنین تعداد باکتری شناسایی شده در سطح جنس، بیانگر تنوع بالای میکروبیوم نماتد مذکور می‌باشد. یافته‌های پژوهش حاضر به‌عنوان اولین گزارش در‌خصوص فلور باکتریایی نماتد بومی Acrobeloides sp. بوده که موید حضور باکتری‌های بیمارگر‌حشرات با‌فراوانی بالا در میکروبیوم این نماتد بومی می‌باشد.
کلیدواژه ها
 
Title
Microbial Metagenomics: Exploring a Native Insect Associated Nematode-Microbiota Through NGS
Authors
Elham Salari, Majid Fasihi Harandi, Mohammad Ali Mohammadi, Mehdi Mansouri Babhootki
Abstract
The metagenomic technique, part of next-generation sequencing (NGS) technology, offers an ideal and culture-independent approach. This method presents new possibilities to uncover the microbial composition of various organisms, including entomopathogenic and entomophilic nematodes, and untangle the complex interactions between these nematodes and their microbiomes. The authors' previous investigations have already revealed the capabilities of the indigenous nematode isolate, Acrobeloides sp., in terms of penetration, reproductive capacity, and notable virulence against some economically important pests such as Zeuzera pyrina. To acquire a comprehensive understanding of the bacterial communities associated with the infective juveniles (IJs) of the native Acrobeloides nematode, the microbiota of the IJs was profiled through NGS metabarcoding amplicon sequencing. According to the manufacturer's protocol, genomic DNA was extracted from the tissues using the DNeasy Blood and Tissue kit. Subsequently, the concentration and purity of the extracted DNA were evaluated using a NanoDrop 2000 spectrophotometer, and the integrity of the DNA was confirmed through agarose gel electrophoresis (1% gel). The Illumina MiSeq platform was utilized for the metagenomic DNA library preparation and downstream NGS process, targeting amplicons from the V3 and V4 hypervariable regions of the 16S rDNA to amplify a 466-bp portion. Following quality control on the raw read fastq files, sequences with low quality, as well as adapter and primer sequences, were removed. The cleaned paired-end reads were then analyzed using QIIME 2. The Amplicon Sequence Variants (ASV) were taxonomically assigned with the SILVA 138 SSURef NR99 taxonomy database, as a reference database, to analyze the microbial communities present in this nematode across various taxonomic levels, encompassing phylum to species classifications. To evaluate the richness and evenness of the microbiota within the Acrobeloides IJs sample, alpha diversity was calculated using three different indices: observed Operational Taxonomic Units (OTUs), Shannon diversity index, and Simpson diversity index. Analysis of the phylogenetic distribution of microbial taxa in Acrobeloides IJs demonstrated that the most abundant bacteria belonged to the phyla Proteobacteria, Bacteriodota, and Firmicutes, accounting for 42.7%, 29.4%, and 18.3% of the community, respectively. Notably, the genus Alcaligenes sp. stood out as the most abundant (11.9%), followed by Myxococcus, Acinetobacter, and Pseudomonas, which were significantly represented in the microbiome of Acrobeloides IJs. The results of evaluating the biodiversity of the Acrobeloides microbiome using the Shannon, Simpson, and Chao1 indices, along with identifying bacteria at the genus level, highlighted a rich and diverse microbial community within Acrobeloides IJs. The present study's findings represent the first record of the bacterial flora within indigenous Acrobeloides nematode populations, affirming the presence of insect-pathogenic bacteria in its microbiome.
Keywords
Microbial profile, Acrobeloides sp, Metagenome Analysis, Illumina platform, Alcaligenes sp